ELISA法测定大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度及药代动力学研究

目的：建立一种检测大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白（PEG-SOP55）浓度的ELISA方法，并进行该蛋白的药代动力学初步研究。方法：以该蛋白的多抗包被，标记生物素的单抗检测，生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶两级酶联放大检测信号，构建双抗夹心ELISA法进行浓度检测。通过对包被抗体和检测抗体工作浓度的优化实验，血清基质的干扰实验，不同结构聚乙二醇分子的比较实验，建立该方法的基本实验条件。并参考相关法规，对其方法特异性、准确度、精密度、耐用性、检测限度以及样品稳定性进行验证。分别用PEG-SOP55_{30 kDa}、PEG-SOP55_{40 kDa}、PEG-SOP55_{40 kDa} branched进行Lewis大鼠腹腔单次给药然后测定血清浓度，获得该蛋白用不同分子结构聚乙二醇分子修饰后的药代动力学参数。结果：实验证实聚乙二醇修饰降低了检测抗体和目标分子的结合效率，且大鼠血清和聚乙二醇分子结构变化对检测有干扰。通过提高包被抗体浓度，获得对目标分子较好的捕获效率。通过将血清样品稀释液从PBS替换为咪唑缓冲液，且保持标准曲线和待测样品血清稀释倍数一致，克服了血清基质所带来的干扰。通过保持标准曲线和待测样品聚乙二醇分子结构一致，克服了因聚乙二醇分子结构不同带来的干扰。方法验证结果表明该方法特异性良好，回收率为（100±15.2）%，实验内精密度和实验间精密度验证数据RSD均不超过20%，不同操作人员对检测结果无显著影响，标准曲线线性良好，标准曲线的最高和最低浓度能够准确测定。将大鼠血清样品反复冻融3次，在室温放置4 h其稳定性均符合要求，满足该方法检测条件。通过对Lewis大鼠血清样品进行浓度测定，获得PEG-SOP55_{30 kDa}、PEG-SOP55_{40 kDa}、PEG-SOP55_{40 kDa} branched的药代动力学参数。其C_max分别为31.9、54.4、67.7 mg·mL^-1，AUC_0-∞分别为823.0、1 978.0、3 502.6 mg·h·mL^-1，t_1/2分别为15.6、22.3、30.6h。结论：成功建立检测PEG-SOP55在大鼠血清中浓度的ELISA方法。通过方法验证表明：该方法专属性、准确度、精密度、线性以及耐用性良好，测定范围为5~80 ng·mL^-1。大鼠血清样品稳定性满足该方法检测要求，该方法可作为PEG-SOP55药代动力学研究的检测方法，也为类似制品的血清浓度检测提供借鉴。初步药代动力学研究表明，随着聚乙二醇分子对蛋白的屏蔽作用增强，能够显著延长其半衰期，提高药物在体内的暴露量。