重组羧肽酶G2对甲氨蝶呤在Wistar大鼠体内代谢特征的影响

目的:建立灵敏稳定的高效液相色谱-二级质谱联用法(HPLC-MS/MS),用于同时测定Wistar大鼠血清中甲氨蝶呤(MTX)及其代谢产物2,4-二氨基-N¹⁰-甲基蝶酸(DAMPA)含量,并研究重组羧肽酶G2(CPG2)在健康大鼠体内对MTX的代谢特征的影响。方法:采用乙腈沉淀蛋白方法进行样品处理。采用HPLC-MS/MS进行分析。使用Thermo Hypersil GOLD C₁₈(100 mm×2.1 mm,5 μm)色谱柱,流动相A为水(含5 mmol·L^-1乙酸铵,pH 3.5),流动相B为甲醇(含0.1%的甲酸),梯度洗脱(0~1.5 min,10%B;1.5~2 min,10%B→90%B;2~5 min,90%B;5~7 min,10%B),流速0.2 mL·min^-1,柱温20 ℃;采用ESI⁺源,MRM离子检测模式,毛细管温度350 ℃,喷雾电压4.5 kV,鞘气压力172.4 kPa,辅气压力68.95 kPa,Collision GAS(CAD)68.95 kPa,Curtain GAS(CUR)68.95 kPa,检测离子反应为MTX(m/z 455.2→308.1),DAMPA(m/z 326.1→175.1)。实验动物分为2组,尾静脉给药,单独给药组(MTX 350 mg·kg^-1)和联合给药组(MTX 350 mg·kg^-1给药5 min后给予CPG2 0.858 mg·kg^-1),测定大鼠血清中MTX和DAMPA的浓度,并计算药代动力学参数。结果:血清中MTX和DAMPA的线性范围均为5~1000 ng·mL^-1(r>0.99),定量下限均为5 ng·mL^-1。MTX的批内与批间精密度(RSD)为2.23%~14.29%,准确度(RE)为-2.83%~6.61%;DAMPA的批内与批间精密度(RSD)为1.78%~13.88%,准确度(RE)为-1.15%~7.00%。MTX和DAMPA的提取回收率范围分别为87.82%~95.09%和89.70%~96.21%,生物基质不干扰样品的测定,样品稀释后检测无稀释效应。本实验涉及条件下样品稳定。结论:建立的HPLC-MS/MS方法可用于测定大鼠血清样品中MTX及其代谢产物DAMPA的浓度,证实了CPG2在大鼠体内对MTX的酶解作用。